Cíl studie: Vytvoření a zavedení metodického postupu pro neinvazivní stanovení RHD genotypu plodu z volné fetální DNA cirkulující v periferní krvi těhotné ženy do klinické praxe. Posouzení citlivosti inovované metodiky pomocí ředící řady a vnitřní kontroly amplifikace. Zjištění detekčního limitu minoritního zastoupení RHD+/- genotypu ve vzorku RHD-/-.
Typ studie: Prospektivní kohortová a metodologická studie.
Název a sídlo pracoviště: Fakultní nemocnice Olomouc: Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny, Porodnickogynekologická klinika, transfuzní oddělení.
Metodika: 1. TaqMan real-time PCR bez vnitřní kontroly amplifikace. 2. Stanovení prahu citlivosti a kalibrace RHD multiplexu TaqMan real-time PCR multiplexem s vnitřní kontrolou amplifikace a kapilární elektroforézou – minisekvenací (SNaPshot – multiplex) s vnitřní kontrolou amplifikace.
Výsledky: 1. RHD pozitivní nebo RHD negativní plod byl určen na základě amplifikačních křivek z real-time PCR systému, které odpovídají stanoveným parametrům pro hodnocení výstupních dat s využitím série kontrol amplifikace a kontaminace. 2. Metody TaqMan real-time PCR systém a minisekvenace byly schopny detekovat 0,22% zastoupení RHD+/- ve vzorku RHD-/-. Minisekvenační systém je vhodný k rozlišení RHD pozitivních homozygotů a heterozygotů. Závěr: V současné době námi zavedený postup založený na detekci exonu 7 genu RHD a sérii paralelních kontrol kontaminace a amplifikace je využívaný v klinické praxi. Obě nově vypracované metody by měly být spolehlivější a po validaci na rozsáhlejším souboru mohou být zavedeny do klinické praxe.
KLÍČOVÁ SLOVA RHD genotypizace – volná fetální DNA – maternální plazma – TaqMan real-time PCR – SNaPshot – minisekvenace
CENTRUM FETÁLNÍ MEDICÍNY
Porodnicko - gynekologická klinika
Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta
Fakultní nemocnice Olomouc
Zdravotníků 248/7, 779 00 Olomouc
Tel: +420 585 852 785
Mobil: +420 606 220 644
E-mail: marek@lubusky.com
Web: www.lubusky.com